US7879586B2
アメリカ
PDFをダウンロード 先行技術を探す 似ている
発明者 山本まり桐田正信無回答Mitsuo Ikeda 現在の譲受人 アサヒビール株式会社 全国農業食糧研究機関
世界中のアプリケーション
2004 JP 2005 CN WO EP 米国
アプリケーションUS11 / 667,590イベント
2004-11-17
JP2004333290Aへの優先順位
2005-11-14
アサヒビール株式会社農業・食品研究機構の申請書
2008-12-25
US20080318272A1の公開
2011-02-01
許可されたアプリケーション
2011-02-01
US7879586B2の発行
2019-03-31
アプリケーションのステータスは期限切れ – 料金関連
2027-10-14
調整された有効期限
すべてのイベントを表示
情報 特許引用(2) 非特許の引用符(14) によって引用される(6) 法的イベント 類似文書 優先順位と関連アプリケーション 外部リンク USPTOUSPTOの割り当てエスパスネットグローバル関係書類話し合います
説明
本出願は、2005年11月14日に出願された国際出願第PCT / JP2005 / 020793号の米国の国内段階である。
技術分野
本発明は、エピガロカテキン−3 − O−ガレート、エピカテキン−3 − O−ガレートまたはそれらの異性体を基質としてメチル化カテキンシンターゼを合成する酵素をコードする遺伝子に関する。本発明はまた、メチル化カテキンシンターゼ遺伝子を組み込んだプラスミド、それを用いた形質転換体、それを用いたメチル化カテキンシンターゼの製造方法、およびそれを用いたメチル化カテキンシンターゼの製造方法に関する。製造方法
背景技術
下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00001
[式中、R1〜R6は水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である]、下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00002
[式中、R 1、Rスルー5は上記で定義したRの少なくとも一方の通りである1 Rスルー5及び異性体は、その天然のような有効な抗アレルギー剤を提供する化合物を発生しているメチル基です]。これらの化合物は、下記化学式(III)で表されるエピガロカテキン-3 - O-ガレートのメチル化により得られる。
図US07879586-20110201-C00003
下記化学式(IV)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート。
図US07879586-20110201-C00004
またはその異性体(特許文献1および非特許文献1)。
近年の生活環境の変化により、アレルギー患者は急増しています。アレルギー疾患の治療は一般的に長い時間がかかり、患者は副作用を引き起こさず、これらの疾患を軽減するために毎日安全に食べることができる食品を食べることが強く推奨されます。したがって、そのような食品に対する大きな必要性がある。エピガロカテキン−3 − O−ガレート(以下、単に「EGCG」と称することがある)は、抗アレルギー作用を有することが知られている茶に含まれる主成分である(非特許文献2)。この化合物は、下記化学式(V)で表される構造を有する。
図US07879586-20110201-C00005
最近の研究により、エピガロカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート等がさらに高い抗アレルギー作用を有することが明らかにされている(特許文献1、非特許文献1)。資料1)。
茶の最も一般的な栽培品種の一つであるヤブキタは、大量のEGCGを含むがエピガロカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレートやエピカテキン-3-O-(3-O)のようなメチル化カテキンを含まないことが知られています。 – メチル)ガレート。セイシンダイパン、ベニホマレ、ベニフジ、ベニフキなど、いくつかの茶種は豊富なメチル化カテキンを含んでいますが、それらのほとんどはまれで入手が困難です。従って、容易に入手可能なEGCGをより価値のあるメチル化カテキンに変換する方法が必要とされている。
非特許文献3、特許文献2および特許文献3には、EGCGをメチル化する方法がいくつか提案されているが、いずれも化学合成や修飾に依存しており、特に3,4,4,5位の水酸基を具体的にメチル化することはできない。以下の式で表されるガロイル基。
図US07879586-20110201-C00006
その上、食品における化学合成化合物の使用を避けることが望ましい。これらの理由から、部位特異的にメチル化カテキンを効率的に合成することができる酵素が必要とされている。
【特許文献1】特開2000-159670号公報
【特許文献2】特開昭61-145177号公報
【特許文献3】特開2002-255810号公報
佐野M、鈴木M、宮瀬T、吉野K、前田山本M:J.Agric。フードケム 47(5)(1999):1906-1910
[非特許文献2] Matsuo、N.ら、Allergy 52(1997):58-64
[非特許文献3] J.Biochem。55(1964):205
発明の開示 発明が解決しようとする課題
従って、本発明の目的は、高い抗アレルギー作用を有する化合物であるメチル化カテキンを効率よく合成することができるメチル化カテキンシンターゼをコードする遺伝子を提供することにある。本発明の他の目的は、そのような遺伝子を組み込んだプラスミドを提供することである。本発明のさらに別の目的は、このプラスミドを用いて形質転換生物を提供することである。本発明のさらに他の目的は、前記形質転換生物を用いてメチル化カテキンシンターゼを製造する方法を提供することにある。本発明のさらに他の目的は、上記製造方法により得られたメチル化カテキンシンターゼを用いてメチル化カテキンを製造する方法を提供することにある。
課題を解決するための手段
これらの目的を達成するために、本発明者らは、メチレートカテキンを含む茶品種の一つであるベニフキの葉からメチル化カテキンシンターゼをコードする遺伝子を単離し、これを大腸菌に導入してメチル化カテキンシンターゼを製造した。具体的には、本発明は以下に関する。
(1)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンを合成する酵素をコードする遺伝子。
図US07879586-20110201-C00007
(R請求項1 Rスルー6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、Rの少なくとも一方1 Rスルー6は、下記一般式で表されるエピカテキン-3-O-ガレート誘導体(II)]メチル基であります:
図US07879586-20110201-C00008
[式中、R 1、Rスルー5は上記で定義したRの少なくとも一方の通りである1 Rスルー5は、1:異性体と、配列番号からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を含む遺伝子のメチル基です] 3と5。
(2)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンを合成する酵素活性を有する酵素をコードする遺伝子。
図US07879586-20110201-C00009
(R請求項1 Rスルー6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、Rの少なくとも一方1 Rスルー6は、下記一般式で表されるエピカテキン-3-O-ガレート誘導体(II)]メチル基であります:
図US07879586-20110201-C00010
[R請求項1 Rスルー5は上記で定義された通りであり、Rの少なくとも一方1 Rスルー5はメチル基である]、およびそれらの異性体、挿入、付加、欠失、または1つ以上の置換されたアミノ酸配列を有する酵素配列番号2、4および6からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基。
(3)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンを合成する活性を有するシンターゼをコードする遺伝子。
図US07879586-20110201-C00011
(R請求項1 Rスルー6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、Rの少なくとも一方1 Rスルー6は、下記一般式で表されるエピカテキン-3-O-ガレート誘導体(II)]メチル基であります:
図US07879586-20110201-C00012
[R請求項1 Rスルー5は上記で定義された通りであり、Rの少なくとも一方1 Rスルー5はメチル基である]、それらから成る群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列と70%以上の相同性を有する遺伝子および異性体配列番号1、3および5。
(4)(1)〜(3)のいずれかに記載の遺伝子を組み込んだ組換え発現ベクター。
(5)(4)に記載の組換え発現ベクターで形質転換された生物。
(6)微生物である、(5)に記載の形質転換生物。
(7)植物細胞、植物組織または植物体である、(5)記載の形質転換生物。
(8)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンを合成する酵素の製造方法。
図US07879586-20110201-C00013
(R請求項1 Rスルー6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、Rの少なくとも一方1 Rスルー6は、下記一般式で表されるエピカテキン-3-O-ガレート誘導体(II)]メチル基であります:
図US07879586-20110201-C00014
[式中、R 1、Rスルー5は上記で定義したRの少なくとも一方の通りである1 Rスルー5は、その異性体と、プロセスであって、メチル基です]。
(6)および(7)のいずれかに記載の形質転換生物を培養して、形質転換生物が培養物中で酵素を産生させること。
培養物から酵素を単離する。そして
酵素を精製する。
(9)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも一種のメチル化カテキンの製造方法。
図US07879586-20110201-C00015
(R請求項1 Rスルー6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、Rの少なくとも一方1 Rスルー6は、下記一般式で表されるエピカテキン-3-O-ガレート誘導体(II)]メチル基であります:
図US07879586-20110201-C00016
[式中、R 1、Rスルー5は上記で定義したRの少なくとも一方の通りである1 Rスルー5は、その異性体と、プロセスであって、メチル基です]。
(6)または(7)のいずれかに記載の形質転換体を培養して、培養物中にメチル化カテキンシンターゼを産生させる工程。
培養物からメチル化カテキンシンターゼを単離する。そして
メチル化カテキンシンターゼと、下記化学式(III)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレートからなる群から選択される少なくとも1つの基質とを反応させること。
図US07879586-20110201-C00017
下記化学式(IV)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート。
図US07879586-20110201-C00018
およびその異性体。
発明の効果
本発明のメチル化カテキンシンターゼ遺伝子が産生するメチル化カテキンシンターゼは、EGCGなどのカテキン類を基質として、抗アレルギー作用、抗がん作用、抗肥満作用、抗動脈硬化作用、抗高血圧作用を有する化合物を有効に生産することができる。抗菌作用
図面の簡単な説明
イチジク。1 誘導酵素の電気泳動(SDS − PAGE)の結果を示す(レーンa =分子量マーカー、レーンb =誘導前、レーンc =誘導後)。
発明を実施するための最良の形態
本明細書において、「メチル化カテキン」とは、下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン-3 - O-ガレート誘導体からなる群から選択される少なくとも1つを意味する。
図US07879586-20110201-C00019
(式中、R1〜R6は水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である。)下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00020
[式中、R 1、Rスルー5は上記で定義したRの少なくとも一方の通りである1 Rスルー5は、その異性体及びメチル基です]。
本発明によるメチル化カテキンの具体例としては、エピガロカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(4 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(3)が挙げられる。 、5 − O−ジメチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(3,4 − O−ジメチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(4−) O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,5 − O−ジメチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,4 − O−ジメチル)ガレートおよびエピ(3 − O−メチル)ガロカテキン – 3-O-ガレート。
本発明のメチル化カテキン合成用酵素(以下、「メチル化カテキンシンターゼ」ともいう)は、エピガロカテキン-3-O-ガレート、エピカテキン-3-からなる群より選択される基質を利用する酵素である。一般式(I)および(II)で表されるものおよびそれらの異性体からなる群から選択される少なくとも1種のメチル化カテキンを製造するためのO−ガレートおよびその異性体。
本発明で使用される遺伝子組換え技術は一般的な技術であり、そして例えば、分子クローニング(Cold Spring Harbor Laboratory Press)に記載されている。
メチル化カテキンシンターゼの目的遺伝子を得るためには、フラボノイド含有植物から、好ましくは茶から、そしてより好ましくはセイシンダイパン、ベニホマレ、ベニフジおよびベニフキなどのメチル化カテキン含有茶栽培品種から全RNAを抽出する。次いで、全RNAを縮重プライマーを用いたRT − PCRにかけて、標的遺伝子の候補として遺伝子断片を得る。
本発明によるメチル化カテキンシンターゼをコードする遺伝子は、配列番号1、3、および5からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列を有する。
本発明の遺伝子は、配列番号1、3および5からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列に対して70%以上の相同性を有し、メチル化カテキンを合成する活性を有する任意のシンターゼをコードし得る。この遺伝子は、メチル化カテキンを合成する活性を有する限り、これらの塩基配列と70%以下の相同性を有していてもよい。
標的遺伝子の候補遺伝子断片は、配列決定することができる任意の適切なベクターにクローニングされる。例えば、ベクターは、所望の遺伝子のためのDNAまたはRNA分子を組み込んだpUCベクターのファミリーまたはpGEMベクターのファミリーであり得る。得られた遺伝子断片を配列決定し、そしてそのヌクレオチド配列に基づいてRACE − PCRを実施して全長遺伝子を得る。
そのようにして得られた遺伝子は次に発現ベクターに組み込まれる。ベクターはタンパク質を発現する任意の適切なベクターであり得る。例えば、ベクターは、所望の遺伝子のためのDNAまたはRNA分子を組み込んでいるpETベクターのファミリーまたはpQEベクターのファミリーであり得る。次に発現ベクターを適切な宿主に導入して所望のタンパク質を発現させる。
ベクターを導入することができる宿主は、植物細胞、植物組織、植物体または微生物であり得る。微生物としては、大腸菌、酵母、バチルス属、カビなどが挙げられる。形質転換宿主は、メチル化カテキンを酵素的に合成する能力を獲得する。
配列番号1、3および5からなる群から選択される少なくとも1つのヌクレオチド配列によってコードされる本発明のメチル化カテキンシンターゼは、配列番号2、4からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列を有する。 、6。
このようにして得られた形質転換生物は次に生物の成長に最適な条件下で培養される。例えば、宿主に導入された発現ベクターがIPTGによって誘導されるとき、化合物は増殖培地に添加されて所望の酵素タンパク質の発現を誘導する。
本発明の遺伝子は、配列番号2、4からなる群から選択される少なくとも1つのアミノ酸配列における1つ以上のアミノ酸残基の挿入、付加、欠失または置換から生じるアミノ酸をコードする任意の遺伝子であり得る。あるいは、本発明の遺伝子は、メチル化カテキンを合成するための酵素活性を有する酵素をコードする任意の遺伝子であり得る。
形質転換生物を作製するために使用される生物は、細胞内で所望の酵素を産生する型のものでも、細胞から酵素を放出する型のものでもよい。後者のタイプが好ましい。細胞から酵素を放出する生物を遠心分離によって培養物から除去して、粗生成物として所望の酵素を得ることができる。細胞内で酵素を産生する生物を超音波処理するかまたはリゾチームで処理して細胞を破壊し、したがって所望の酵素を粗生成物として得ることができる。粗酵素はさらに処理することなくカテキンのメチル化に使用することができるが、分子量分画または他の適切な技術によって精製するのが好ましい。
精製した酵素を4.5〜8.5、好ましくは6.5〜8のpHを有する緩衝液に懸濁する。この懸濁液に、EGCGまたはECGをS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)と一緒に添加し、そして反応を室温で進行させる。メチル化カテキンを形成するために、5〜60℃、好ましくは20〜40℃である。

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
例1 ベニフキからのトータルRNAの抽出
紅雪茶葉(1 g)を液体窒素中で粉砕し、全RNAを抽出した。下記に示すような縮重プライマーを設計し、そしてそのプライマーを使用して全RNA(2μg)をRT − PCRにおいて増幅した。
5′-縮重プライマー: CAGTAYATWYTNGARACHAGTGT
3′-縮重プライマー: TGTGRGCAACDCCRGCTTTYTBAATE
(シーケンスコード:Y = C、T; W = A、T; R = A、G;
H = A、T、C。D = G、A、T。B = G、T、C。そして
N = A、C、G、T)
RT-PCR産物をアガロースゲル電気泳動によって確認し、増幅されたcDNAバンドをアガロースゲルから精製した。cDNAをpGEM − Tベクター(Promega)にクローニングし、そのベクターを大腸菌株JM − 109(Takara)に導入した。得られたJM-109株をLB培地中37℃で振とうしながら一晩培養した。続いて、プラスミドを抽出し、そしてインサートcDNAを配列決定した。
例2 全長遺伝子の単離
単離した遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて特異的プライマーを設計した。このプライマーを用いて、5′-および3′-RACE PCRを行い、全長cDNAを得た。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、増幅したバンドをゲルから精製した。精製cDNAをpGEM-Tベクターにクローニングし、そして配列決定した。このようにして、目的とする酵素タンパク質の全長遺伝子を単離した。
次いで、全長遺伝子のヌクレオチド配列に基づいて5′-および3′-プライマーを設計した。これらのプライマーを用いて、全RNA(3μg)に対してRT − PCRを行い、目的とする酵素の全長遺伝子を単離した。得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動により分離し、増幅したバンドをゲルから精製した。精製したcDNAをpGEM-Tベクターにクローニングした。ベクターを大腸菌株JM109 に導入し、cDNAを再度配列決定した。ヌクレオチド配列および推定アミノ酸配列を配列表に示す。
実施例3 酵素タンパク質発現の誘導
RT-PCR中にプライマーによって導入された、所望の酵素タンパク質の遺伝子挿入物ならびに制限酵素NdeIおよびBamHIの制限部位を含むpGEM-TベクターをNdeIおよびBamHIで消化した。消化したDNAをアガロースゲル電気泳動に供し、遺伝子インサートを精製した。pET28a(+)ベクター(Novagen)もNdeIおよびBamHIで消化し、アガロースゲル電気泳動に供し、そしてゲルから精製した。インサートをNdeIとBamHI部位の間のpET28a(+)ベクターにクローニングし、そのベクターを大腸菌に導入した。BL21(DE3)株(ストラタジーン)。得られたBL21(DE3)株を振盪しながら37℃のLB培地で一晩培養した。その後、培養液の一部を新しいLB培地に移して再度培養した。次いで、IPTGを最終濃度1mMまで培養物に添加し、細胞を振盪しながら28℃で培養して酵素を誘導した。次に培養物を遠心分離(7,000rpm×10分、4℃)して細胞を回収した。細胞ペレットを1mM DTTを含有する20mM PBS(pH7.4)に懸濁した。細胞懸濁液を超音波処理して細胞を破壊し、そして再び遠心分離した(7,500rpm×10分、4℃)。上清を0.45μmのフィルターでろ過し、ろ液を粗酵素液とした。大腸菌:誘導された細胞について約27kDaにバンドが観察され、これは所望の酵素タンパク質の発現を示している。推定アミノ酸配列から決定された酵素タンパク質の分子量は27.6kDaであった。誘導された酵素タンパク質についての電気泳動の結果は図1に示される。イチジク。1.
実施例4 酵素反応
以下の反応系において粗酵素液を用いてカテキンのメチル化カテキンへの変換を行った。
100mM Tris-HCl(pH 6.8)
0.2mM MgCl2
25μMEGCGまたはECG
80μMのS-アデノシル-L-メチオニン(SAM)
総容量5ミリリットル
反応を30℃で1時間進行させ、次いで1NのHCl(200μl)を添加することにより終結させた。続いて、8mLの酢酸エチルを添加し、そして反応混合物を振盪した。遠心分離(3000G、5分)後に有機相を集め、それに1%アスコルビン酸(200μl)を加えた。この混合物を真空濃縮し、次のメチル化カテキンの生成についてHPLCにより分析した:エピガロカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(4 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン-3-O-(3,5-O-ジメチル)ガレート、エピガロカテキン-3-O-(3,4-O-ジメチル)ガレート、エピカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレート、エピカテキン – 3 − O−(4 − O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,5 − O−ジメチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,4 − O−ジメチル)ガレートおよびepi(3) −O−メチル)ガロカテキン−3 − O−ガレート。結果は、エピガロカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(4 − O−メチル)ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(3,5 − O−ジメチル)のそれぞれを示す。 )ガレート、エピガロカテキン−3 − O−(3,4 − O−ジメチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3 − O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(4 − O−メチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,5 − O−ジメチル)ガレート、エピカテキン−3 − O−(3,4 − O−ジメチル)ガレートおよびエピ(3 − O−メチル)ガロカテキン−3 − O−ガレートは、生産されたそしてそれらの量は使用された粗酵素の量に依存した(表1)。エピガロカテキン−3 − O−ガレート(EGCG)、エピカテキン−3 − O−ガレート(ECG)またはS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)が反応系から除去された場合、メチル化カテキンはいずれも形成されなかった。エピカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレート、エピカテキン-3-O-(4-O-メチル)ガレート、エピカテキン-3-O-(3,5-O-ジメチル)ガレート、エピカテキン-3 −O−(3,4 − O−ジメチル)ガレートおよびエピ(3 − O−メチル)ガロカテキン−3 − O−ガレートが生成し、それらの量は使用した粗酵素の量に依存していた(表1)。エピガロカテキン−3 − O−ガレート(EGCG)、エピカテキン−3 − O−ガレート(ECG)またはS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)が反応系から除去された場合、メチル化カテキンはいずれも形成されなかった。エピカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレート、エピカテキン-3-O-(4-O-メチル)ガレート、エピカテキン-3-O-(3,5-O-ジメチル)ガレート、エピカテキン-3 −O−(3,4 − O−ジメチル)ガレートおよびエピ(3 − O−メチル)ガロカテキン−3 − O−ガレートが生成し、それらの量は使用した粗酵素の量に依存していた(表1)。エピガロカテキン−3 − O−ガレート(EGCG)、エピカテキン−3 − O−ガレート(ECG)またはS−アデノシル−L−メチオニン(SAM)が反応系から除去された場合、メチル化カテキンはいずれも形成されなかった。
これらの結果は、メチル化カテキンを合成する活性を有する酵素が得られたことを示している。
表1
酵素反応により生成されるメチル化カテキンの量(μg/ ml)
添加した酵素量(ml)
0 0.05 0.1 0.5 1.0 2.0
エピガロカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレート 0 0.8 2.8 9.9 32.9 45.4
エピガロカテキン-3-O-(4-O-メチル)ガレート 0 0.2 0.3 0.6 2.6 5.7
エピガロカテキン-3-O-(3,5-O-ジメチル)ガレート 0 0.3 1.3 2.2 14.1 44.9
エピガロカテキン-3-O-(3,4-O-ジメチル)ガレート 0 0.1 0.4 0.9 5.1 21.3
エピカテキン-3-O-(3-O-メチル)ガレート 0 0.7 2.4 1.2 30.1 42.2
エピカテキン-3-O-(4-O-メチル)ガレート 0 0.2 0.4 0.9 2.9 4.8
エピカテキン-3-O-(3,5-O-ジメチル)ガレート 0 0.2 1.6 2.8 12.5 49.6
エピカテキン-3-O-(3,4-O-ジメチル)ガレート 0 0.1 0.2 0.7 3.8 16.6
エピ(3-O-メチル)ガロカテキン-3-O-ガレート 0 0.6 2.2 8.3 26.3 38.1
産業上の利用可能性
本発明のメチル化カテキンシンターゼ遺伝子によって生産されるメチル化カテキンシンターゼは、高い抗アレルギー活性を有する化合物であるメチル化カテキンを効率的に生産するための基質としてEGCGおよび他のカテキンを利用することができる。したがって、本発明は非常に重要である。
(配列表)
クレーム(7)
以下からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンの合成を触媒する酵素をコードする単離された遺伝子。
a)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00021
式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である。
b)下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00022
[式中、R1〜R5は前記と同じ意味を表し、R1〜R5のうち少なくとも1つはメチル基を表す。
c)それらの異性体。
ここで、遺伝子は、配列番号1、3および5からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
以下からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンの合成を触媒する酵素をコードする単離された遺伝子。
a)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00023
式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である。
b)下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00024
[式中、R1〜R5は前記と同じ意味を表し、R1〜R5のうち少なくとも1つはメチル基を表す。
c)それらの異性体。
酵素は、配列番号2、4および6からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
以下の遺伝子を含む組換え発現ベクター。 請求項1 または 2.
に記載の組換え発現ベクターを含む単離された宿主細胞。 請求項3.
ベクターの組換え発現を含む形質転換生物。 請求項3ここで前記生物は植物細胞、植物組織または植物体である。
以下からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンの合成を触媒する酵素の製造方法。
a)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00025
式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である。
b)下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00026
[式中、R1〜R5は前記と同じ意味を表し、R1〜R5のうち少なくとも1つはメチル基を表す。
c)それらの異性体。
以下のプロセス
に従って形質転換生物を培養する。 請求項5 形質転換生物が培養物中で酵素を産生できるようにする。
培養物から酵素を単離する。そして
酵素を精製する。
以下からなる群から選択される少なくとも1つのメチル化カテキンを製造する方法。
a)下記一般式(I)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00027
式中、R1〜R6はそれぞれ水素原子またはメチル基であり、R1〜R6の少なくとも1つはメチル基である。
b)下記一般式(II)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート誘導体。
図US07879586-20110201-C00028
[式中、R1〜R5は前記と同じ意味を表し、R1〜R5のうち少なくとも1つはメチル基を表す。
c)それらの異性体。
以下のプロセス
に従って形質転換生物を培養する。 請求項5 形質転換生物が培養物中でメチル化カテキンシンターゼを産生することを可能にする。
培養物からメチル化カテキンシンターゼを単離する。そして
メチル化カテキンシンターゼを、からなる群から選択される少なくとも1つの基質と反応させること。
a)下記化学式(III)で表されるエピガロカテキン−3 − O−ガレート。
図US07879586-20110201-C00029
b)下記化学式(IV)で表されるエピカテキン−3 − O−ガレート。
図US07879586-20110201-C00030
c)それらの異性体。
特許引用(2)
発行番号 優先日 発行日 譲受人の タイトル
US6465229B2 * 1998-12-02 2002-10-15 E. I. Du Pont De NemoursおよびCompany 植物カフェオイル – コアo – メチルトランスフェラーゼ
家族から家族への引用
JP2002255810A 2001-02-27 2002-09-11 東京フードテクノ株式会社 新抗菌剤、新規カテキン誘導体およびその製造方法
*審査官による引用、†第三者による引用
非特許引用(14)
タイトル
Brandenら、Introduction to Protein Structure、Garland Publishing Inc.、ニューヨーク、p。247、1991年 *
キャメロン、E.、モレキュラー・バイオテクノロジー7:253-265、1997 *
Database Uniprot [Online]、2004年7月5日、Database Accession No. Q6PUA7(対応する出願EP 05806065について欧州調査報告に引用されている)。
G.Busamら、「Vitis vinifera Lの誘導抵抗性応答のために提案されたカフェオイル – コエンザイムA 3 − O−メチルトランスフェラーゼの特徴付けおよび発現」、Plant Physiol。115、pp.1039−1048、1997。
Gardrickら、Med。SCI。MONIT。11(4):RA110-121、2005 *
Houdebine、L.、バイオテクノロジー98のジャーナル:145-160、2002 *
カッペルら、バイオ3の現在の意見:548から553、1992 *
Meyerrnans H等。リグニンの合成およびリグニン生合成に関与する酵素であるカフェオイル – コエンザイムA O−メチルトランスフェラーゼのダウンレギュレーションによるポプラ木部におけるフェノール性グルコシドの蓄積J.Biol。Chem。2000 275:36899−36909。2000年8月8日に発行されたJBC Papers in Press(欧州特許出願公開第05806065号明細書に引用)。
Mullins et al。、Hypertension 22(4):630-633、1993。 *
Phillips、A.、J.Pharm。薬理学53:1169年から1174年、2001年 *
Sefernickら、J.Bacteriol。183(8):2405から2410、2001 *
Tangらは、GenBank登録番号AAT37172、2004年5月 *
Tangらは、GenBankアクセッション番号AY600140、2004年5月 *
Witkowskiら、Biochemistry 38:11643から11650、1999年 *
*審査官による引用、†第三者による引用
から引用(6)
発行番号 優先日 発行日 譲受人の タイトル
US20100324312A1 * 2007年2月7日 2010年12月23日 株式会社の管理用庁国立農業・食品産業技術総合研究機構 それを含む新規メチル化カテキンと組成
家族から家族への引用
WO2010067599A1 * 2008-12-09 2010-06-17 静岡県公立大学法人 Process for efficiently producing alkylated catechin
JP5763521B2 * 2009-03-02 2015-08-12 アサヒグループホールディングス株式会社 Methyl transferase enzyme
JP5714809B2 * 2009-06-24 2015-05-07 アサヒ飲料株式会社 茶抽出物の製造方法、製剤中に含まれるメチル化カテキン類カテキン類の濃度を高める方法および茶粉末茶粉末。
JP5852866B2 * 2011-12-01 2016-02-03 森永製菓株式会社 ポリフェノールのメチル化方法およびそれを用いたメチル化ポリフェノールの製造方法
CN103864745B * 2014年3月5日 2015年5月20日 、湖南農業大学 メチル化EGCG(エピガロカテキンガレートの調製方法 )
*審査官による引用、†第三者による引用、‡家族から家族への引用
類似ドキュメント
出版物 出版日 タイトル
クリステンセン等。 1999 大麦子葉鞘ペルオキシダーゼ。病原体による精製、分子クローニング、および誘導
KR100954975B1 2010-04-30 アセト乳酸合成酵素を コード する遺伝子
KR101802547B1 2017-11-28 ステビオール配糖体の組換え生産
Forreiter等。 1993 山の松(Pinus mugo)における光非依存性および光依存性のプロトクロロフィリド還元活性と2つの異なるNADPH‐プロトクロロフィリドオキシドレダクターゼポリペプチド
JP6223187B2 2017-11-01子葉 害虫に対する抵抗性を付与する核酸分子
Park et al。 2004 サツマイモの細胞培養からのサイトゾルアスコルベートペルオキシダーゼcDNAの分子クローニングとストレスに応答したその発現
Schuhmann et al。 植物細胞の異なる細胞内区画におけるタンパク質品質管理およびプロセシングにおける 2012 Degプロテアーゼおよびそれらの役割
KR19990088053A 1999-12-27 イソプレノイド生産の改善
KR20010108234A 2001-12-07 フコシルトランスフェラーゼ遺伝子
Wittstock等。 2007 グルコシノレートの加水分解におけるスケール-指定子タンパク質をティッピング
Shenら。 2006 クローニングおよび根特異的発現遺伝子をコード3-ヒドロキシ-3-メチルグルタリル補酵素の特徴付けイチョウからレダクターゼを
黄等。 2001 サツマイモの葉の老化上方制御遺伝子のクローニングと特性化
プエリンガー他。 2003 MdAP、リンゴの新規タンパク質は、主要アレルゲンMal d 1と関連しています1
Plaumann等。 1997 Euglena gracilisからのcDNAにより明らかにされたクラスIアルドラーゼの葉緑体への多重補充と真核生物クラスIIアルドラーゼの真正細菌起源
アンダーソン等。 Arabidopsis thalianaの根と葉からの 2009 ミロシナーゼは異なる触媒特性を有する
AU701065B2 1999年1月21日 のアシル基転移活性を有するタンパク質をコードする遺伝子
JP2003503027A 2003-01-28 芳香族化合物を酸化する方法
Luersen et al。 1999年 熱帯熱マラリア原虫由来の推定γ-グルタミルシステインシンテターゼは大きな挿入と可変縦列反復を含む
Rodríguez-Martínら。 新規抗真菌タンパク質PgAFPとPenicillium chrysogenumのコード遺伝子の 2010 特性
Heimendahlらによって。 Linum albumおよびLinum usitatissimumとは異なる立体特異​​性を持つ 2005年 ピノレジノール – ラリシレシノールレダクターゼ
Van Damme他。 1997年 主要なエルダーベリー(Sambucus nigra)果実タンパク質は、トランケート型2型リボソーム不活性化タンパク質に由来するレクチンです。
マクリーン等。 1993 Drosophila melanogasterのパンチ遺伝子座からの複数のmRNAは、異なるN末端ドメインを有するGTPシクロヒドロラーゼIのアイソフォームをコードする。
スティールら。 2005年 フェニルアラニンアミノムターゼの精製、クローニング、および機能的発現:タキソール側鎖生合成における最初の関与段階
CN100537768C 2009-09-09 窒素の調節下で改善されたgrowtnを示す植物を構築する方法
KR100861437B1 2008-10-02 アラビドプシスからのベータ1,2-キシロシルトランスフェラーゼ遺伝子
優先順位と関連アプリケーション
優先アプリケーション(3)
出願 優先日 出願日 タイトル
JP2004333290A 2004-11-17 2004-11-17 メチル化カテキン生合成酵素をコードする遺伝子
特開2004−333290 2004−11−17
PCT / JP2005 / 020793 2004-11-17 2005-11-14 メチル化カテキン合成酵素をコードする遺伝子
法的イベント
日付 コード タイトル 説明
2007-06-28 AS アサインメント
所有者名:株式会社アドミニストレーションエージェンシーナショナルアグリク
自由形式のテキスト:譲渡人の利益の譲渡;譲渡人:山本真理;桐田雅信;他雅夫;その他:リール/フレーム:019522/0155;署名期限20070528から20070622まで
所有者名:アサヒビール株式会社
自由形式のテキスト:譲渡人の利益の譲渡;譲渡人:山本真理;桐田雅信;他雅夫;その他:リール/フレーム:019522/0155;署名期限20070528から20070622まで
所有者名:株式会社アドミニストレーションエージェンシーナショナルアグリク
自由形式のテキスト:譲受人の利益の譲渡;譲渡人:山本真理;桐田雅信;同志真真;そしてその他の署名日:20070528から20070622まで;リール/フレーム:019522/0155
所有者名:アサヒビール株式会社
自由形式のテキスト:譲受人の利益の譲渡;譲渡人:山本真理;桐田雅信;同志真真;そしてその他の署名日:20070528から20070622まで;リール/フレーム:019522/0155
2011-10-17 AS アサインメント
オーナーネーム:旭グループホールディングス株式会社
自由形式のテキスト:前にリール019522に記録されているINVENTOR S ADDRESSを訂正するための正しい割り当て0155 20070528から20110701まで;リール/フレーム:027074/0628
2014-09-12 REMI メンテナンス料リマインダを郵送
2015-02-01 LAPS Lapseがメンテナンス料の支払いに失敗しました
2015-03-24 FP メンテナンス料未払い
発効日:20150201
IFIが提供するデータクレーム特許サービス
https://patents.google.com/patent/US7879586B2/en