恵美子関根・鈴木、 郁夫中西 * 、 浩平今井AB、 めぐみ上野、 隆下川 * 、 ケン・イチロー松本Aと清福原 * B定量的酸化還元センシングチーム(QRST)、放射線のための基礎医学科学科263-8555、千葉県稲毛区、放射線・科学技術研究所(QST)、放射線科学研究所(NIRS)による被害。メールアドレス:nakanishi.ikuo@qst.go.jp ; FAX:+ 81-43-255-6819。Tel:+ 81-43-206-3131 bORCIDロゴORCIDロゴORCIDロゴORCIDロゴ
〒142-8555東京都品川区昭和大学薬学部
2017年12月7日 、2018年3月2日に受理される
2018年3月13日に初公開
X線や重イオンビームのプラトー領域などの低線形エネルギー移動(LET)放射線による生物学的損傷の約3分の2は、最も強力な反応性であるヒドロキシルラジカル(˙OH)によって引き起こされることが知られています。生成された酸素種(ROS)を介して水分子のイオン化と励起 従って、ROSに対して有効な掃去活性を有する化合物は放射線防護活性を示すことが期待される。イソプロピルフラグメントが(+) – カテキンのカテコール環に導入された平面カテキン類似体は、(+) – カテキンと比較してラット胸腺細胞におけるX線誘発アポトーシスに対して有効な保護効果を示した。平面カテキンは、298Kでリン酸緩衝液(0.1M、pH7.4)中の(+) – カテキンよりも約10倍速くβ-シクロデキストリンによって水中に可溶化された2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル(DPPH)を捕捉した。さらに、実験ログ[薄いスペース(1/6 em)]P平面カテキンの値(1.22)は、(+) – カテキンの値(0.44)よりも有意に大きいと報告されている。(+) – カテキンよりも平面カテキンのより高いラジカル消去活性および親油性は、ラット胸腺細胞におけるX線誘発アポトーシスに対するより高い保護活性に部分的に寄与し得る。
前書き
電離放射線は癌治療のための有効な方法の一つです。癌患者の生活の質(QOL)を維持するために、内臓の形状を維持することができる放射線療法に対する需要が近年増加している。しかしながら、腫瘍に隣接する正常組織に対する放射線療法の悪影響は無視できない。放射線に対する正常組織の耐性が改善され得るならば、より高い線量の放射線が使用され得る。1 X線や重イオンビームのプラトー領域などの低線形エネルギー移動(LET)放射による生物学的損傷の約3分の2は、ヒドロキシルラジカル(˙OH)によって引き起こされることが知られています。生成された最も強力な活性酸素種(ROS)、を経由してイオン化し、水の分子の励起。2従って、ROSに対して捕捉活性を有する化合物は放射線防護活性を示すと期待される。ラジカルスカベンジャーのうち、チオホスフェートであるアミホスチン(WR − 2721)は、有意な放射線防護活性を示し、そして放射線療法を受けている患者に対して米国食品医薬品局(FDA)によって承認されている。しかしながら、アミホスチンの毒性はその使用を大いに制限している。3
天然の抗酸化剤は効率的なラジカル消去活性とほとんど毒性を示さないので、それらは最近放射線防護剤の候補としてかなりの関心を集めている。4最近、我々はラット胸腺細胞を用いた化学化合物の放射線防護活性を評価するための簡単で簡単な方法を開発し、そして(+) – カテキン、レスベラトロール、カフェイン酸およびケルセチンのような天然の抗酸化剤がXに対して有効な防護活性を示すことを示した。ラット細胞におけるX線誘発アポトーシス 5一方、我々は、ラジカル消去活性を向上させるために、天然の酸化防止剤の化学修飾を調査しました。オルト位および/またはパラ位へのメチル基の導入酸化防止剤中のフェノール性水酸基に対して、それらのラジカル捕捉活性の有意な増強をもたらした。6化学修飾された抗酸化剤の中で、イソプロピルフラグメントが(+) – カテキンに導入された平面カテキン類似体(図1)は、アセトニトリル中の(+) – カテキンと比較して5倍強力なラジカル消去活性を示した。フェントン反応に対する保護作用は、酸化促進作用を伴わずにDNA損傷を誘発した。7また、アセトニトリル中での(+) – カテキンのラジカル消去反応が(+) – カテキンからラジカルへの電子移動を経て、対応する(+) – カテキンのラジカルカチオンを生成し、続いてプロトン移動することを報告した。8平面状カテキンのC6 ‘位(図1)の電子供与性イソプロピル基はラジカルカチオン中間体を安定化させ、そのようなラジカル捕捉活性の増強をもたらし得る。事実、平面状カテキンの酸化電位は(+) – カテキンのそれよりも著しく低いと報告されている。7cさらに、Bernini et al。メチル化平面カテキン誘導体はメチル化(+) – カテキン誘導体よりはるかに容易に酸化されることを報告した。9平面カテキンはまた、顕著なαグルコシダーゼ阻害、および抗ウイルスおよび抗腫瘍活性などのいくつかの生物学的活性を示します。7日、10日本発明者らは、(+) – カテキンのそれと比較して、ラット胸腺細胞においてX線に対する平面カテキンの放射線防護活性がアポトーシスを誘導したことを報告する。カテキン類のラジカル消去速度およびそれらの親油性のような化学的データと共にラット胸腺細胞を用いた生物学的データは、毒性なしに有効な放射線防護剤を開発するための基本的かつ貴重な情報を提供する。
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図1 カテキンの化学構造
実験的
材料
(+) – カテキンはSigmaから購入し、シリカゲルカラムクロマトグラフィー(7 [薄いスペース(1/6 em)]:[薄いスペース(1/6 em)]3 [薄いスペース(1/6 em)]:[薄いスペース(1/6 em)]1トルエン – アセトン – メタノール)で精製した。平面カテキンは、文献に報告されている手順に従って合成した。図7a、D、E、 2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル(DPPH)は、商業的に和光純薬(株)、日本から入手しました。β-シクロデキストリン(β- CD)は、東京化成工業株式会社から購入し、水から再結晶し、313Kで真空乾燥した。この研究で使用した水は、Milli - Qシステム(Millipore)を用いて新たに調製した。直接Q UV 3)。文献に報告されている手順に従って、DPPHUをβ- CDによって水中に可溶化した。11
動物たち
すべての動物実験は、施設のガイドラインに準拠した国立放射線科学研究所(NIRS)で行われ、NIRSの施設内動物管理使用委員会によって承認された。雄のWister-MSラットは、Japan SLC、Inc。から8週齢で入手した。ラットは、それぞれ23±1℃および55±5%の温度および湿度制御の部屋に収容し、一晩飼育した。 12時間の明暗サイクル。ラットをケージあたり2匹飼育した。実験期間中、彼らは酸性化された水と食事(MB-1、船橋農場、日本)を自由に摂取した。
胸腺細胞サンプルの調製
10〜15週齢のラットの胸腺を冷たいダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(Sigma)で洗浄して余分な脂肪を取り除き、10%ウシ胎児血清(FBS)を添加したRoswell Park Memorial Institute培地(RPMI 1640)(Sigma)に入れた。 。胸腺を切断し、ピンセットを用いて胸腺細胞に圧迫した。これらの細胞をニヨンメッシュを通して懸濁し、次いで遠心分離機(SAKUMA M-160-IV)を用いて4℃で1500rpmで5分間遠心分離した。細胞ペレットを10%FBSを含むPRMI 1640に再懸濁し、細胞数を顕微鏡(OLYMPUS IX-70)下で計数した。細胞を氷上で1ウェルあたり5.0×105細胞の密度で48ウェルプレートに播種した。
X線照射
Shimadzu Pantak HF-320を使用して線量率1.2 Gy min -1で細胞にX線を照射した。(実効エネルギー80keV、管電圧200kV、管電流20mA、0.5mmアルミニウム+ 0.5mm銅フィルター)。線量計を用いて放射線量を決定した。X線照射前後の胸腺細胞の典型的な顕微鏡画像は、我々の以前の論文に示されています。5a
フローサイトメトリー分析
照射後、細胞を37℃、5%CO 2で4時間インキュベートした。インキュベーション後、胸腺細胞のサイズおよび数をフローサイトメーターFACS Calibur(Becton Dickinson Company)で測定した。[薄いスペース(1/6 em)]各サンプルについて少なくとも10000個の細胞を測定し、データをBD CellQuest Proソフトウェア(Becton Dickinson Company)で分析した。
スペクトルおよび動力学的測定
リン酸緩衝液(0.1 M、pH 7.4)中のカテキンによるDPPHの消去反応の速度は、β-CD可溶化DPPHの混合後のDPPHによる527 nmでの吸光度変化をモニターすることによって決定した(DPPH /β-)。298KでUNISOKU RSP − 1000−02NM分光光度計でストップフロー技術を使用して1[薄いスペース(1/6 em)]:[薄いスペース(1/6 em)]1の体積比でカテキンを含有するリン酸緩衝溶液(0.2M、pH7.4)を含む水中(Milli − Q)中のCD)。したがって、リン酸緩衝液の最終濃度は0.1Mである。kobs値は、アップルマックブックプロパーソナルコンピュータを使用して最小二乗曲線当てはめによって決定された。LNの一次プロット(A – A ∞)対時間(A及びA∞は、反応時の吸光度として表され、最終吸光度は、相関係数 ρ> 0.999で3以上の半減期まで線形であった。
結果と考察
ラット胸腺細胞におけるX線誘発アポトーシスに対するカテキンの保護活性
図1の2つのカテキンの放射線防護活性は、これらの文献に報告されている評価方法を用いて調べられた。5化合物の放射線防護活性は、ラット胸腺細胞において放射線によって誘発されるアポトーシスの頻度を定量することによって推定されます。ラット由来の胸腺細胞を、10%FBSを添加した細胞培養培地(RPMI 1640)に入れた。カテキンを共溶媒としてDMSOに溶解し、細胞懸濁液に適用した(1、10、100または1000μM)。胸腺細胞を、共溶媒としてDMSO 0.1%またはDMSO 0.1%を含むカテキンのいずれかで前処理した。2GyのX線照射後、細胞を5%CO2で37℃で4時間インキュベートした。インキュベーション後、胸腺細胞の大きさと数をフローサイトメーターで測定した。図2は、カテキン(1 mM)の有無にかかわらず、X線照射(0または2 Gy)後の細胞サイズの分布を示しています(他の濃度については、図S1、ESI †を参照)。対照細胞は約400で鋭いピークを示し、約250で小さなピークを示す(図2a)一方、2 GyのX線照射では約400でピークの高さが減少し、約400でピークが増加した。 250(図2b)。図2dおよびfは、X線照射前にそれぞれ1mM(+) – カテキンおよび平面カテキンで処理した胸腺細胞を示し、400付近のピークの減少が有意に抑制され、これらのカテキンがラット胸腺細胞を保護することを示唆する。 。図2cとe1mMカテキン自体は胸腺細胞においてアポトーシスを誘導しなかったことを示す。図3の白および灰色の棒は、それぞれX線照射の有無によるアポトーシス細胞の割合を示す。化合物の存在下での白い棒がその非存在下でのものよりも大きい場合(対照)、化合物はX線照射なしで胸腺細胞に対して毒性を示す。したがって、(+) – カテキンと平面状カテキンの両方で毒性は観察されなかった(図3)。一方、化合物の存在下で小さい灰色のバーは、その化合物が放射線防護活性を示すことを示す。対照試料では、2GyのX線照射が約40%の胸腺細胞においてアポトーシスを誘導した一方で、約20%の胸腺細胞がX線照射なしで死亡した(図3)。)図3に示されるように、X線照射によって誘発されたアポトーシスは、平面カテキン前処理によって濃度依存的に効率的に抑制された。化学物質の放射線防護効率を定量化するために、化学物質を含むアポトーシス細胞の割合を化学物質を含まないアポトーシス細胞の割合で割ったものとして、比修飾因子(RMF)を定義する。化合物のRMF値が低いほど、放射線防護活性は高くなる。この研究において、10、100および1000μMの平面カテキンは、それぞれ0.7、0.1および0のRMFを示した(表1)。対照的に、10、100および1000μM(+) – カテキンは、それぞれ0.9、0.9および0.4RMFを示した(表1)。)したがって、平面カテキンは、(+) – カテキンと比較して、ラット胸腺細胞におけるX線誘発アポトーシスに対して著しくより効率的な放射線防護活性を示した。
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図2 ラット胸腺細胞のフローサイトメーター分析。(a)細胞を0.1%DMSOの存在下で4時間インキュベートした。(b)2GyのX線照射後、細胞を0.1%DMSOの存在下で4時間インキュベートした。(c)細胞を共溶媒としての1mM(+) – カテキンおよび0.1%DMSOの存在下で4時間インキュベートした。(d)2GyのX線照射後、細胞を共溶媒としての1mM(+) – カテキンおよび0.1%DMSOの存在下でインキュベートした。(e)細胞を共溶媒としての1mM平面カテキンおよび0.1%DMSOの存在下で4時間インキュベートした。(f)2GyのX線照射後、細胞を共溶媒としての1mM平面カテキンおよび0.1%DMSOの存在下でインキュベートした。
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図3 2 Gy X線照射なし(白棒)および有り(灰色棒)のラット胸腺細胞におけるアポトーシスに対するさまざまな濃度の平面カテキンおよび(+) – カテキンの効果。
表1 カテキンのRMF値
濃度/μM 死細胞率/% RMFによる保護
IRなし X線2 Gy
コントロール 20.25±1.37 41.51±0.11 1.0±0.01
平面カテキン10 19.80±2.11 33.66±2.33 0.7±0.03
100 21.45±0.37 27.66±0.05 0.1±0.02
1000年 18.98±0.88 21.09±1.22 0±0.03
(+) – カテキン10 21.01±0.42 40.65±0.80 0.9±0.04
100 21.63±0.17 39.76±0.86 0.9±0.04
1000年 20.23±0.93 28.62±1.05 0.4±0.05
リン酸緩衝液中の平面カテキンのラジカル消去活性
最近、我々は2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジルラジカル(DPPH˙)、ROSの反応性モデルとして頻繁に使用される12-16がβ-シクロデキストリン(β-CD)を使用して水に可溶化できることを報告した。)11これにより、生理的条件下で緩衝液中の抗酸化剤のラジカル消去活性を評価することができます。したがって、(+) – カテキンおよび平面状カテキンのラジカル消去活性は、リン酸緩衝液(0.1M、pH7.4)中のβ- CD可溶化DPPH(DPPH /β- CD)を用いて調べた。リン酸緩衝液(0.2M、pH7.4)中の(+) – カテキンとDPPH /β- CDの水(Milli - Q)溶液とを1の体積比で混合したとき[薄いスペース(1/6 em)]。[薄いスペース(1/6 em)]ストップフロー分光光度計で図1に示すように、DPPH /β- CDに起因する527nmの吸収帯は、図4に示すように429nmの明確な等吸収点で直ちに減少した。527nmでの吸光度の減衰は、(+) – カテキンの濃度が10倍過剰のDPPH /β- CD濃度よりも高いときに、擬似一次速度論に従った(図4の挿入図)。擬一次速度定数(kobs)は、(+) – カテキン濃度([(+) – カテキン])が増加するにつれて直線的に増加した(図5)。線形プロットの傾きに基づいて、(+) – カテキンとDPPH /β− CDとの間の反応についての二次速度定数(k)を298Kでリン酸緩衝液(0.1M、pH7.4)中で決定した。 9.9×10になる2M −1s −1。平面カテキンとDPPH /β- CDとの間の反応についてのk値も同様にして9.6×103M-1s-1であると決定され、これは(a)の場合と比較してほぼ10倍大きい。 +) – カテキン。したがって、平面状カテキンは、リン酸緩衝液(0.1M、pH7.4)中で(+) – カテキンよりもはるかに強いラジカル消去活性を示す。
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図4 リン酸緩衝液(0.1 M )中で(+) – カテキン(1.9 x 10 -3 M)とDPPH /β-CD(3.2 x 10 -5 M)を反応させたときのスペクトル変化(間隔:20 ms)。、pH7.4)、298K。挿入図:527nmでの吸光度に基づく擬一次プロット。
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図5 k obs対 [(+) – カテキン](白丸)および[平面カテキン](黒丸)のプロット。
また、実験ログ[薄いスペース(1/6 em)]Pの平面カテキン(1.22)の値は、(+)よりも有意に大きいことが報告されている-カテキン(0.44)、17親油性ならびに平面カテキンの膜透過性がに比べて高くなっていることを示します(+) – カテキン。
結論
平面カテキンは、(+) – カテキンと比較して、ラット胸腺細胞における放射線誘発アポトーシスに対して著しくより効率的な放射線防護活性を示した。平面状カテキンのより高いラジカル消去活性ならびに親油性は、部分的には(+) – カテキンよりもそのようなより高い放射線防護活性に寄与し得る。放射線癌治療を高度化するためには、腫瘍周囲の正常組織に対する有害な副作用なしに放射線防護剤を開発することがかなり重要である。この研究で得られた結果は、平面カテキンが放射線がん治療と組み合わせて使用​​できる有望なリード化合物の1つである可能性があることを示唆しています。天然および合成の酸化防止剤を使用して、有効な放射線防護剤の構造活性相関を調べるために、さらなる実験が進行中です。
利益相反
宣言するための競合はありません。
謝辞
この研究はNIRSのFACSサポートチームと動物実験サポートチームによってサポートされていました。この作品は、文部科学省の助成金(ESにはNo. 17K18375、INには26460056、KIには15K18901)によって部分的に支援されました。
メモと参照
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脚注
† 利用可能な電子補助情報(ESI):フローサイトメトリーの図。DOI:10.1039 / c7ra13111aを参照
このジャーナルは、©The Royal Society of Chemistry 2018です。
https://pubs.rsc.org/en/content/articlehtml/2018/ra/c7ra13111a